一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)約時間，也節(jié)約經費。

　　三槽梯度PCR儀你真的了解嗎?

　　加熱模塊：上孔與孔之間的溫度一致性對于獲取可靠而可重復的PCR結果也是至關重要的。確保熱準確性的一種方法就是經常使用溫度驗證試劑盒進行檢測，溫度驗證檢測通常可用于：

　　在等溫模式下相對于設定溫度的孔間準確性；

　　在溫度轉換后相對于設定溫度的孔間準確性；

　　熱蓋溫度的準確性。

　　引物退火溫度控制：

　　梯度溫度控制是PCR儀一項有助于PCR中引物退火優(yōu)化的功能。梯度設定的目的是在模塊之間實現(xiàn)變化的溫度，通過每列之間≥2°C的溫度升降，可同時對于不同溫度進行測試以獲取引物退火溫度。理論上，梯度可在模塊之間實現(xiàn)線性的溫度。

　　然而，傳統(tǒng)梯度PCR儀通常采用單一的熱模塊并通過位于兩端的兩個加熱及冷卻元件進行溫度的控制，經常會導致以下限制：

　　僅能設置兩個溫度：在熱模塊的兩端設置成引物退火的高、低溫度，無法在模塊間實現(xiàn)其他溫度的準確設置。由于不同列之間的熱交換，模塊上不同區(qū)域間的溫度更可能遵循的是S形的曲線變化而非線性梯度。

　　三槽梯度PCR儀對于樣品溫度控制的能力對于PCR結果的準確性十分重要。儀器特異性的參數(shù)如升降溫速度，維持時間以及算法對于預測樣品溫度是關鍵。升降溫速度意味著在一定時間內發(fā)生的PCR步驟之間的溫度變化。由于熱量從模塊傳輸至樣品需要一定的時間，樣品實際的升降溫速度會較慢。因此，對于變溫速度的定義需要進行區(qū)分和了解。